STUDIUL STRUCTURAL ȘI FUNCȚIONAL AL PEPTIDELOR CU GLICINĂ ȘI PROLINĂ (GLIPROLINE) CA
Preț:
Autorii lucrării:
Revista științifică:
Anul publicării:
STUDIUL STRUCTURAL ȘI FUNCȚIONAL AL PEPTIDELOR DE GLICINĂ ȘI PROLINĂ (GLIPROLINE) CA POTENȚIAL NEUROPROTECTORI
CHIMIA BIOORGANICĂ, 2009, Volumul 35, Nr. 2, p. 165-171
STUDIUL STRUCTURAL ȘI FUNCȚIONAL AL PEPTIDELOR CU GLICINĂ ȘI PROLINĂ (GLIPROLINE) CA POTENȚIAL NEUROPROTECTORI
*Academia de Stat de Tehnologie Chimică Fină din Moscova, numită după V.I. M.V. Lomonosov,
O schemă pentru sinteza peptidelor care conțin glicină și prolină y-Pro)^ (Pro-Gly-Pro)n (n = 2, 3) și (Pro-Gly-Pro)n (n = 1, 2) a fost dezvoltat.Dipeptidele Gly-Pro și Pro-Gly asupra supraviețuirii celulelor de feocromocitom PC12 de șobolan de cultură în condiții de stres oxidativ indus de incubarea pe termen scurt a celulelor cu peroxid de hidrogen.concentrații de 0,2-100 μM reduc numărul de celule deteriorate. dipeptida Gly-Pro are cea mai mare activitate, care la o concentrație de 100 μM reduce numărul de celule deteriorate cu o medie de 49%.
Cuvinte cheie: sinteza peptidelor; peptide care conţin glicină şi prolină; stresul oxidativ; necroză; cultură de celule de feocromocitom PC12 de șobolan.
În prezent, peptidele naturale și sintetice constând doar din reziduuri de glicină și prolină, numite gliproline, sunt de mare interes [1–3]. Se presupune că sursa de gliproline naturale din organism este colagenul și proteinele înrudite atât de origine endogenă, cât și cele furnizate cu alimente [2]. Conform datelor obținute până acum, peptidele Pro-Gly, Pro-Gly-Pro și Gly-Pro-Gly-Gly este capabil să suprime procesele de coagulare a sângelui [47], Pto-Gly, Pro-Gly-Pro și Gly-Pro-Gly-Gly protejează mucoasa gastrică de diferite efecte ulcerogene [8-10], iar peptida ciclică Pro -Gly are impact asupra sistemului nervos central [11].
Anterior, am arătat că un analog sintetic al fragmentului de hormon adrenocorticotrop 4-10, semax, care conține secvența C-terminală Pro-Gly-Pro, are un efect citoprotector asupra culturii de celule neuroendocrine de feocromocitom PC12 de șobolan în condiții de stres oxidativ. 12]. Analiza produselor metabolismului semax a arătat că fragmentul Pro-Gly-Pro a fost chiar mai activ decât peptida originală [13].
Acest fapt ne-a permis să sugerăm că și alte gliproline pot avea activitate citoprotectoare.
Scopul acestei lucrări a fost obținerea unui număr de noi gliproline sintetice și studierea efectului lor citoprotector asupra supraviețuirii culturii de celule PC12 sub stres oxidativ.
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Sinteza peptidelor. Pentru obținerea peptidelor s-au folosit metode de sinteză în fază lichidă cu extensie secvențială a lanțului, ceea ce a făcut posibilă evitarea racemizării. Condensarea fragmentelor a fost folosită și pentru a reduce timpul de sinteză (schema).
Pro-a1u-Pro-01u(Sh) 01u-Pro-01u-Pro-01u-Pro (V)
Pro-a1u-Pro(1) —- 01u-Pro-01u-Pro (II)
Pro-a1u-Pro-Pro-a1u-Pro (IV) Pro-01u-Pro-01u-Pro (VI)
Sistem. Prepararea gliprolinelor sintetice.
Alegerea grupărilor protectoare a fost determinată de strategia de sinteză și de posibilitatea îndepărtării lor selective. În lucrare au fost utilizați aminoacizi protejați la capete N și C: derivați Boc și esteri benzilici (OB/1).
Tabelul 1. Caracteristicile intermediarilor
Denumirea compusului Cod Т °С *pl> ^ wi (sistem)
Vos-Pro-01u Vos-(USh) 70 0,863 (B); 0,746 (A); 0,903 (E); 0,847 (I)
Boc-Pro-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(I)-0Bz1 125-126 0,326 (B); 0,390 (D); 0,947 (G); 0,620 (A)
Vos-Pro-01u-Pro Vos-(1) 60 0,851 (B); 0,201 (V)
Pro-G1y-Pro-0Bz1 (I)-0Bz1 0,246 (B); 0,674 (G); 0,474 (A)
Boc-G1y-Pro-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(P)-0Bz1 67 0,240 (B); 0,664 (G); 0,495 (A)
Boc-1y-Pro-1y-Pro Boc-(II) 0,280 (A); 0,275 (G)
Boc-Pro-G1y-Pro-G1y-0Bz1 Boc-(PI)-0Bz1 78-80 0,573 (B); 0,728 (G)
Boc-Pro-1y-Pro-1y Boc-(III) 0,273 (H); 0,372 (G)
G1y-Pro-G1y-Pro-0Bz1 (P)-0Bz1 0,232 (V)
Boc-Pro-G1y-Pro-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(UI)-0Bz1 56 0,810 (W); 0,115 (V)
Boc-Pro-1y-Pro-1y-Pro Boc-(V1) 0,654 (W)
Boc-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(UP)-0Bz1 67 0,302 (W); 0,523 (G)
Vos-1y-Pro Vos-(UP) 88 0,723 (W)
Boc-G1y-Pro-G1y-Pro-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(V)-0Bz1 75 0,532 (B); 0,674 (G)
Boc-1y-Pro-1y-Pro-1y-Pro Boc-(Y) 0,353 (W), 0,977 (E)
Boc-Pro-G1y-Pro-Pro-G1y-Pro-0Bz1 Boc-(IY)-0Bz1 74 0,465 (G); 0,403 (A)
Boc-Pro-1y-Pro-Pro-1y-Pro Boc-(IV) 0,527 (W), 0,623 (E)
Inițial, sinteza compușilor Boc-01v-Pro-OB/1 și Boc-Pro-01v-Pro-OV/1 a fost efectuată prin metoda carbodiimidei; peptidele au folosit metoda anhidridei mixte. Alegerea acestei metode s-a datorat simplității sintezei, randamentelor relativ mari și disponibilității reactivilor. Sinteza a avut loc la temperaturi scăzute (de la -20 la -40°C) timp de câteva minute. Reacțiile au fost efectuate în solvenți organici apoși, ceea ce a făcut posibilă rezolvarea problemei solubilității glicinei neprotejate. Pentru activarea aminoacizilor sau peptidelor dizolvate protejate de Bocîn acetonitril s-a folosit clorură de pivaloil (P1y-C1). Utilizarea grupului de protecție Boc și temperaturile scăzute au făcut posibilă reducerea posibilității de racemizare. Dezavantajul acestei metode de sinteză a fost necesitatea controlului constant al condițiilor de temperatură.
Metoda carbodiimidei a fost utilizată pentru a condensa Boc-Pro-Biy-Pro cu Bio-OB/1 [14]. Pentru a preveni racemizarea, a fost utilizat 1-hidroxibenzotriazol. Randamentul Boc-Pro-01u-Pro-01u-0B/1 a ajuns la 69%.
Derivați protejați ai peptidei Pro-v1y-Pro (I): Boc-Pro-v1y-Pro (Boc-(I)) și Pro-01y-Pro-0B/1 ((P-0Br1 Boc-01u-Pro-01u) -Pro-0B/1 (Boc-(II)-0Br1) a fost sintetizat din f-OVr!, Boc-Pro-01u-Pro-01u-0V/ 1 (Boc-(W)-0B/1), din Boc -(1) și 0>0Br1 - Boc-Pro-01y-Pro-Pro-01u-Pro-0B/1
(Vos-(1U)-0V/1). În plus, peptidele protejate Boc-Pro-01u-Pro-v1u-Pro-0B/1 (Boc-(U1)) și Boc-01u-Pro-01u-Pro-01u-Pro -0V/1 (Vos-(U) -0V/1). Randamentele și caracteristicile compușilor intermediari sunt prezentate în tabel. 1. Îndepărtarea grupării Boc a fost efectuată prin hidroliză acidă, iar 0B/1 - prin hidrogenare catalitică. După îndepărtarea grupărilor protectoare, peptidele (1)-(Y1) rezultate au fost transformate în formă de acetat. Acest lucru le-a îmbunătățit solubilitatea în apă și, de asemenea, a oferit un pH acceptabil după dizolvare (interval 4,5-6).
Progresul reacţiei a fost monitorizat prin TLC. Randamentele de produs în toate etapele sintezei sunt prezentate în „partea experimentală”. Caracteristicile produselor finale sunt prezentate în tabel. 2. După cum se poate observa din datele de mai sus, randamentele produselor finale au ajuns la 80-94%. Conform rezultatelor spectrometriei de masă, vârfurile moleculare ale peptidelor corespund greutății lor moleculare, iar datele analizei elementare au fost în deplin acord cu valorile calculate.compoziție elementară.
Evaluarea activității citoprotectoare a gliproli-
nou Pentru a evalua efectul citoprotector al peptidelor, a fost utilizată o cultură de celule neuroendocrine de feocromocitom PC12 de șobolan [15]. În prezența factorului de creștere a nervilor, celulele acestei culturi sunt capabile să se diferențieze în celule de tip neuronal. Moartea neuronală cauzată de stresul oxidativ a fost modelată pe cultura PC12. Pentru a face acest lucru, celulele au fost expuse la H2O2 timp de 30 de minute, apoi H2O2 a fost îndepărtat. Acest impact a dus la
Tabelul 2. Caracteristicile produselor finite
Denumirea compusului Formula brută t * pl' °С 22 (sistem) t/g, (M+) Compoziție elementară, %
Codul [a] în (cu 1, MeOI) calculat experimental
Pro-Ny-Pro (I) C14I20K3O 76 -70,02 0,23 (B) 269,95 51,02 84,92 0,85 51,22 85,33 0,92
ay-Pro-ay-Pro (II) ScD^O, 86 -104,03 0,117 (A); 0,092 (D) 327,12 49,90 83,60 1,07 49,87 83,60 1,05
Pro-ay-Pro-ay (Sh) C1bI2sM4O7 93 -89,63 0,245 (W); 0,374 (E) 327,88 49,94 83,81 1,02 49,87 83,60 1,05
Pro-au-Pro-Pro-Pro-au-Pro (IV) 83 -108,03 0,658 (3) 423,92 52,16 87,01 1,11 52,28 87,09 1,04
ay-Pro-ay-Pro-ay-Pro (V) C23I33C509 93-95 -105,6 0,373 (E); 0,153 (W) 480,87 51,15 85,59 1,12 51,20 85,67 1,12
Pro-ay-Pro-ay-Pro (VI) C2bUs7Mb09 96 -156,44 0,375 (3) 520,95 53,74 89,39 1,02 53,88 89,42 1,04
dezvoltarea proceselor necrotice, în special, la încălcarea integrității membranei celulare, care este detectată deja la câteva ore după inducerea stresului oxidativ. Pe lângă peptidele sintetizate (1>-(V1), peptidele v1y-Pro (VII) şi Pro-v1y (VIII) au fost de asemenea incluse în studiu.
Compușii studiați la o concentrație de 5 μM au avut efecte diferite asupra supraviețuirii celulelor (Fig. 1). Deci peptidele (I), (II), (Y) și (VII)a redus numărul de celule deteriorate comparativ cu martor (incubare fără peptidă) și (IV) - în aceeași con-
centrarea a crescut numărul celulelor deteriorate cu 32%. În cazul compușilor (III), (VI) și (VIII), nu au existat diferențe semnificative față de martor.
Astfel, peptidele cu structura (01y-Pro)n (II), (V) și (VII) și peptida Pro-v1y-Pro (I) au avut un efect citoprotector.
Pentru a compara eficacitatea peptidelor (I), (II), (V) și (VII), activitatea lor citoprotectoare a fost determinată în intervalul de concentrație de 0,2-100 μM (Fig. 2). Se arată că în toate cazurile obţinute
- (VII) (II) (V) (VIII) (III) (I) (IV) (VI) K (01u-Pgs)n (Pgs-01u)n (Pro-01u-Pro)n
Orez. 1. Efectul gliprolinelor asupra supraviețuirii celulelor PC12 sub stres oxidativ. K - control (incubarea de 30 de minute a celulelor cu H2O2 și incubarea ulterioară fără peptide). **R